A pedido de várias famílias vou tentar explicar o que tenho andado a fazer no ITQB.
Ora eu tenho estado a fazer mutagénese dirigida.
Começo por fazer um PCR com o DNA que pretendo mutar e com primers desenhados para o efeito. O que é PCR?
PCR - Polymerase Chain Reaction (em português - reacção em cadeia da polimerase) é um método de amplificação (de criação de múltiplas cópias) de DNA (ácido desoxirribonucleico) sem o uso de um organismo vivo.
O método PCR pode ter início com uma quantidade muito pequena de DNA original - até mesmo o DNA deixado em uma impressão digital poderá ser usado. Durante o processo de PCR, o DNA original é copiado por uma enzima, chamada DNA polimerase, que duplica a cadeia de DNA. Geralmente, só uma pequena parte da cadeia de DNA é copiada usando PCR. Esta parte é seleccionada por iniciadores (primers), curtas cadeias artificiais de DNA (20-40 pares de bases), que se combinam exactamente com cada região terminal da parte a ser copiada. Além do DNA original (que vai servir de base para providenciar as cópias), dos iniciadores e da polimerase, é ainda necessária a presença de desoxirribonucleótidos - as unidades básicas da cadeia de DNA.
A máquina de PCR (termociclador) é basicamente um forno onde um programa controla o tempo e a temperatura.
Aparelho de PCRO processo de PCR consiste em várias iterações, geralmente 15-30, e cada iteração é composta pelos passos seguintes :
1. Desnaturação (94-96ºC, 30-600 segundos). Durante a desnaturação, a cadeia dupla do DNA é separada em duas cadeias simples, da mesma forma que se abre um "fecho-éclair". A DNA polimerase é estável a altas temperaturas pois é obtida de organismos que vivem em ambientes extremos (extremófilos). A DNA polimerase mais usada é a Taq polimerase (obtida de Thermus aquaticus).
2. Annealing (emparelhamento) (45-80º C, 30-120 segundos). Durante o emparelhamento, os iniciadores ligam-se ao DNA de cadeia simples e a DNA polimerase liga-se aos iniciadores emparelhados.
3. Alongamento (65-80º C, 30-120 segundos). Durante o alongamento, a DNA polimerase cria a cadeia de DNA complementar à medida que percorre o DNA de cadeia simples, incorporando desoxirribonucleótidos presentes na reacção.O bloco de iteraçōes é precedido por um passo único de desnaturação, a fim de assegurar que todo o DNA da amostra se encontra na forma de cadeias simples. Após o bloco de iteraçōes é comum haver um passo extra de alongamento para que a polimerase possa completar todas as novas cadeias formadas. Após cada iteração, a quantidade de DNA duplica. Assim, após múltiplas iterações, o aumento da quantidade de DNA é previsto por uma exponencial de base 2. Por exemplo, após 30 iterações, uma cadeia de DNA é copiada em 230 = 1 073 741 824 cadeias, que são cópias exactas da parte da primeira cadeia seleccionada pelos iniciadores.
O PCR encontra sua principal aplicação em métodos que necessitam de uma quantidade de DNA maior que a disponível. Em teoria, é possível amplificar qualquer DNA. Uma das principais aplicações do PCR é na medicina forense, onde pequenas amostras de DNA retiradas da cena de um crime (pedaços de cabelo, gotas de sangue ou saliva, pedaços de pêlo ou até mesmo a minúscula quantidade de DNA deixada em uma impressão digital) são amplificadas para serem analisadas pelo método de fingerprinting. O PCR também é utilizado para amplificar sequências de DNA para sofrerem mutagénese, para detectar mutações ou para preparar fragmentos a serem utilizados em outros experimentos (inserção em vectores de expressão, por exemplo).
Após ter o PCR pronto faço a digestão dos produtos do PCR, com uma endonuclease, DpnI durante a noite, de forma a eliminar o DNA que não está mutado.
Posteriormente transformo o DNA em E. coli XL1-Blue. Estão aí uma fotos dos meus "girinos"... E depois plaqueio. Em placa tem esse aspecto, quando resulta claro.
E.coli
Quando obtenho colónias inoculo uma durante a noite num meio líquido e no dia seguinte extraio o DNA e após fazer uma electroforese, para quantificar a quantidade que tenho, mando sequenciar para saber se tenho mutação ou não.
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